Synergy H1에서
형광 측정 조건을 잡을 때
체크해야 할 사항
같은 시료라도 파장, Gain, 측정 방향, 플레이트, 시료량과 background 조건에 따라 형광 측정 결과는 크게 달라질 수 있습니다. 좋은 데이터는 높은 신호보다 재현 가능한 측정 조건에서 시작합니다.
형광 측정에서 중요한 것은
단순히 RFU를 크게 만드는 것이 아닙니다
검출 신호가 높더라도 포화 영역에 있거나 background와의 차이가 작다면 정량성이 떨어질 수 있습니다. 실험 목적에 맞는 광학 조건과 측정 범위를 먼저 설정해야 합니다.
파장이 형광체의 최대 excitation / emission 영역에서 벗어나 있거나 Gain, 읽기 높이, 시료량이 적절하지 않은지 확인할 필요가 있습니다.
높은 RFU가 항상 좋은 결과를 의미하지 않습니다. 강한 시료가 detector의 측정 범위를 넘어가면 샘플 간 실제 차이를 구분하기 어려워질 수 있습니다.
측정 전에 먼저 확인할 5가지
Emission 형광체에 맞는 파장 선택
Excitation과 Emission
파장을 먼저 확인합니다
형광체는 특정 파장에서 가장 효율적으로 빛을 흡수하고 다른 파장에서 형광을 방출합니다. 따라서 사용 중인 dye 또는 assay kit의 excitation / emission spectrum을 기준으로 측정 파장을 설정하는 것이 기본입니다.
특히 두 개 이상의 형광체를 사용하는 경우에는 각 spectrum의 중첩 영역까지 함께 확인해야 합니다.
최대 신호만 찾기보다는 background와 간섭을 함께 고려하여 signal-to-background가 좋은 영역을 찾는 것이 중요합니다.
Gain은 높을수록
좋은 것이 아닙니다
Gain을 높이면 약한 형광 신호를 더 크게 검출할 수 있지만, 강한 시료에서는 신호가 detector의 측정 범위를 넘어가 포화될 수 있습니다.
낮은 농도부터 높은 농도까지 측정하는 실험에서는 전체 샘플이 유효한 측정 범위 안에 들어가는지 확인하는 과정이 중요합니다.
가장 강한 sample을 기준으로 포화를 피하면서 낮은 농도 영역을 충분히 구분할 수 있는 조건을 찾습니다.
Top Read와 Bottom Read,
샘플 위치를 생각합니다
형광을 어디에서 읽을 것인지는 assay 형태에 따라 달라집니다. 용액 기반 형광 assay라면 전체 well의 신호를 고려해야 하고, 바닥에 부착된 세포 기반 assay에서는 세포 위치와 검출 광학 경로가 중요합니다.
동일한 sample이라도 측정 방향과 read height에 따라 검출 효율이 달라질 수 있으므로 assay 특성에 맞는 설정이 필요합니다.
세포 기반 assay라면 세포가 실제로 존재하는 위치와 형광 신호의 발생 위치부터 생각해 보세요.
용액 기반 assay 등에서 활용
부착 세포 기반 assay 등에서 고려
플레이트와 시료량도
광학 조건의 일부입니다
well geometry, 플레이트 색상과 재질, sample volume은 광학 경로와 background에 영향을 줄 수 있습니다.
형광 assay에서는 일반적으로 인접 well의 빛 간섭을 최소화할 수 있는 적절한 microplate 선택도 중요합니다.
실험 조건을 비교할 때는 플레이트 종류와 sample volume까지 동일하게 유지해야 데이터 재현성을 높일 수 있습니다.
Blank와 Background를
반드시 함께 확인합니다
배지, buffer, serum, microplate 자체에서도 일정 수준의 fluorescence background가 발생할 수 있습니다.
따라서 signal 자체의 크기만 보는 것이 아니라 blank 또는 negative control과 비교하여 실제 assay에서 발생한 신호가 얼마나 되는지 확인해야 합니다.
특히 낮은 농도의 sample에서는 absolute RFU보다 signal-to-background 차이가 더 중요할 수 있습니다.
Monochromator와 Filter,
왜 둘 다 필요한가?
Synergy H1은 monochromator 기반 광학계와 filter 기반 광학계를 결합한 Hybrid Multi-Mode Reader입니다. 연구 목적에 따라 유연성과 민감도를 함께 고려할 수 있습니다.
조건 탐색의 유연성
별도의 필터 교체 없이 wavelength를 선택할 수 있어 새로운 fluorophore 또는 다양한 assay의 측정 조건을 탐색하는 데 유용합니다.
- 다양한 wavelength 설정
- 새 assay 조건 탐색
- Spectral optimization
- Variable bandwidth 활용
전용 assay의 성능
특정 wavelength를 사용하는 assay에서는 목적에 맞는 filter optics를 이용하여 측정 조건을 구성할 수 있습니다.
- 특정 wavelength 최적화
- Fluorescence Polarization
- Time-Resolved Fluorescence
- TR-FRET 등 확장 assay
새 형광 assay라면
이 순서로 조건을 잡아보세요
결과가 예상과 다를 때
먼저 확인해 볼 부분
형광값이 너무 낮다
Excitation / emission wavelength, Gain, sample 농도와 volume, read direction 및 plate 조건을 순서대로 점검합니다.
Background가 높다
Buffer와 media 자체의 autofluorescence, plate 재질, blank 구성 및 spectral overlap 가능성을 확인합니다.
Well 간 편차가 크다
Pipetting, mixing, sample volume, 기포, plate 위치와 incubation 조건이 일관되게 유지되었는지 확인합니다.
측정 직전 빠른 체크리스트
이런 연구실이라면
Synergy H1을 검토할 수 있습니다
하나의 특정 assay보다 여러 검출 방식을 사용하는 환경
여러 dye와 wavelength를 다루며 조건 탐색이 필요한 환경
온도 조절과 다양한 측정 조건이 필요한 cell-based workflow
현재 assay뿐 아니라 향후 새로운 workflow까지 고려하는 환경
본 페이지는 형광 기반 microplate assay의 조건 설정 시 고려할 요소를 이해하기 쉽게 정리한 연구 가이드입니다. Synergy H1 관련 Hybrid optical system, variable bandwidth 및 지원 기능 정보는 Agilent BioTek Synergy H1 공식 기술 자료를 기준으로 구성했습니다. 개별 assay의 최종 측정 조건은 사용 중인 reagent, fluorophore, plate 및 sample 조건에 따라 최적화가 필요합니다.
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